引言

生物流體（如血液、尿液、唾液等）中細(xì)菌的存在與人類生活和公共健康密切相關(guān)。在疾病初期及時、準(zhǔn)確鑒定致病菌種類對確認(rèn)致病菌感染源和阻止疾病傳播至關(guān)重要。傳統(tǒng)細(xì)菌檢測方法有平板計數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISAs）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCRs）等，這些技術(shù)雖然促進了細(xì)菌檢測的發(fā)展，但仍存在耗時長、勞動密集、實驗成本高等不足。雙重酶級聯(lián)反應(yīng)具備更低的活性位點，傳質(zhì)速度快、反應(yīng)效率高等優(yōu)勢，近年來被越來越多的用于生物傳感檢測領(lǐng)域。

近期，南京師范大學(xué)王琛教授課題組采用一步還原法制備了雙重酶級聯(lián)反應(yīng)Au@POM 納米顆粒子，實驗采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為模型，以可見光波段光譜吸收強度為依據(jù)，分析細(xì)菌代謝過程中葡萄糖濃度與細(xì)菌代謝速度關(guān)系。實驗證明，Au@POM納米酶級聯(lián)催化反應(yīng)在細(xì)菌含量為1-7.5 x 10⁷ CFU mL^-1呈線性關(guān)系，檢測限為5 CFU mL^-1。

結(jié)果分析

納米酶級聯(lián)催化的細(xì)菌檢測原理如圖1所示，采用一步還原法制備Au@POM 納米顆粒，金屬氧酸鹽（POMs）為殼、金納米粒子（AuNPs）為核。金納米顆粒（AuNPs）具備葡萄糖氧化酶（GOx）活性，金屬氧酸鹽（POMs）具備過氧化物酶（HRP）活性，制備的Au@POM 納米顆粒具備雙重酶活性。實驗時采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為模型，在細(xì)菌生長和繁殖過程中需要消耗葡萄糖能源，理論上葡萄糖含量越高，細(xì)菌含量越低，因此可將葡萄糖含量與細(xì)菌含量的線性關(guān)系作為細(xì)菌定量分析的可行性策略。首先，AuNPs的葡萄糖氧化酶活性將葡萄糖底物氧化為葡萄糖酸，并產(chǎn)生H₂O₂，然后，利用POMs的過氧化物酶活性，將3’,3’5’,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化為TMB⁺,形成強可見光吸收峰。

圖1納米酶級聯(lián)催化的細(xì)菌檢測原理示意圖。（A） 一步還原法制備Au@POM（B） 級聯(lián)催化Au@POM納米酶。（C） 細(xì)菌在代謝過程（D）細(xì)菌/無細(xì)菌生物體系中可見光吸收強度。

圖2 (A) Au@POM 納米顆粒TEM圖像，顆粒直徑15nm，Au核的POM薄層厚約1nm；（B）SEM圖和EDS圖譜；（C）納米顆粒ζ電位圖；（D）不同材料XRD圖；（E）Au與Au@POM的可見光吸收譜，介電常數(shù)改變導(dǎo)致Au@POM紅移

圖3 （A）不同體系可見光吸收光譜；（B）Au@POMs + Glu + TMB納米酶級聯(lián)催化體系可見光吸收譜峰與反應(yīng)時間關(guān)系；（C）對葡萄糖濃度做Michaelis–Menten模型的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)測定（TMB濃度為1.2mM）；（D）納米酶級聯(lián)反應(yīng)的雙倒數(shù)圖

實驗時采用金黃色葡萄球菌作為模型，隨著細(xì)菌含量增加，吸收峰強度明顯降低，在濃度為10-1x10⁷ CFU mL^-1區(qū)間，細(xì)菌含量與吸收峰強度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，金黃色葡萄球菌檢測限為5 CFU mL^-1。作者同步做大腸桿菌對比實驗，其吸光度強度隨細(xì)菌濃度變化趨勢與金黃色葡萄球菌相似，結(jié)果表明Au@POMs納米酶級聯(lián)催化反應(yīng)具有良好的普適性。

圖4 （A）納米酶級聯(lián)反應(yīng)細(xì)菌檢測原理示意圖；（B）不同尺寸金黃色葡萄球菌的暗場視野圖像（0,10,10²-10⁷ CFU·mL^-1）；（C）加入不同含量細(xì)菌后的可見光吸收光譜圖；（D）人體血清樣品和PBS緩沖液的細(xì)菌檢測

結(jié)論

本文采用一步還原法合成納米酶級聯(lián)反應(yīng)Au@POMs納米顆粒，該體系制備的Au@POM 納米顆粒具備雙重酶活性，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為模型，采用暗場顯微鏡直接觀測細(xì)菌形貌，并通過不同細(xì)菌模型的可見光吸收光譜進行細(xì)菌濃度的半定量分析。結(jié)果表明，細(xì)菌含量與可見光吸收強度具備良好的線性關(guān)系。將金黃色葡萄球菌摻入10%血清中，結(jié)果與在PBS緩沖液中結(jié)果相似，表明該方法在真實樣品檢測中具備潛在應(yīng)用，為高靈敏度實施細(xì)菌檢測提供了有力工具。

南京師范大學(xué)王琛教授課題組簡介

王琛，南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師，國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者（2020年），江蘇省“青藍(lán)工程"優(yōu)秀青年骨干教師、中青年學(xué)術(shù)帶頭人；南京師范大學(xué)本科、碩士，2011年博士畢業(yè)于南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生命分析國家重點實驗室，2012-2016南京大學(xué)從事物理學(xué)博士后，2016-2017年麻省理工學(xué)院（MIT，美國）訪問學(xué)者。至今，在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表研究論文60 余篇；參編英文圖書 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley)；主持多項國家自然科學(xué)基金、江蘇省重點研發(fā)、江蘇省自然科學(xué)基金等項目；擔(dān)任Chinese Chemical Letters期刊編委，中國分析測試協(xié)會青年學(xué)術(shù)委員會委員，江蘇省材料學(xué)會副秘書長。

文章信息

本文以“Nanozyme-catalyzed cascade reaction enables a highly sensitive detection of live bacteria"為題發(fā)表在Journal of Materials Chemistry B上，中國藥科大學(xué)柳文媛教授和南京師范大學(xué)王琛教授為通訊作者。

本研究暗場顯微圖像使用的是北京卓立漢光儀器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，如需了解該產(chǎn)品，歡迎咨詢。

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